密花石斛離體組織培養的步驟

⑴ 植物組織培養一般的的流程

植物組織培養的流程：

第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鍾至數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。

第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈台或接種箱內完成，准備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手錶等。用70%酒精浸10～30秒。由於酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。

第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1～2種使用見表。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視採用的消毒液種類，涮洗3～10次左右。

(1)密花石斛離體組織培養的步驟擴展閱讀

組織培養技術是在人為創造的無菌條件下將生活的離體器官（如根、莖、葉、莖段、原生質體）、組織或細胞置於培養基內，並放在適宜的環境中，進行連續培養以獲得細胞、組織或個體的技術。

組織培養技術原理

植物組織培養的原理是細胞全能性。也就是說每個植物細胞里都含有一整套遺傳物質，只不過在特定條件下才會表達。

組織培養基於此原理就可以將已處於分化終端或正在分化的植物組織脫分化，誘導形成愈傷組織，再在愈傷組織上形成新的叢生芽。

組織培養技術的應用

（1）改良作物：增加遺傳變異性。

（2）繁殖植物：組織培養中從一個單細胞，一塊愈傷組織，一個芽（或其它器官）都可以獲得無性系。無性系就是用植物體細胞繁殖所獲得的後代。

（3）有用化合物：有用化合物包括葯物、橡膠、香精油、色素等。這些化合物許多都是高等植物的次生代謝物，有些化合物還不能大規模地人工合成，而靠植物產生這些化合物來源有限。因此，利用組織培養方法，培養植物的某些器官或愈傷組織，並篩選出高產、高合成能力、生長快的細胞株系，以進行工業化生產，是一條行之有效的途徑。

⑵ 植物離體快繁的基本程序(植物組織培養)

植物組織培養的基本程序其實你說的很清楚了，那我就簡單解釋每個過程，看看是否如你所願。
1、外植體選擇
包括根、莖、葉、花、根等在內的幾乎所有植物的器官（細胞全能性）都可以選取作為外植體材料，然後進行消毒培養，誘導脫分化形成愈傷組織。
2、增殖培養
將愈傷組織經過合適的培養基、激素等內部條件和光照、溫度等外部條件培育後使其再次分化形成叢生芽（如果是蘭花的根狀莖則可直接進行擴增），這個過程其實就包含了增殖，可以對新形成的分化程度較低的材料再次進行切割培養，形成更多的後代。
3、生根發芽
對擴增出來的叢生芽進行進一步培養，可以有兩個方向，一是選取合適條件使其有利於芽伸長，另一是使其有利於生根，經過這個階段後長出來的就是小苗了。
4、移栽
移栽組培苗涉及到煉苗的過程，因為組培苗所待的溫室環境和室外環境畢竟相差很大，而且從無菌環境帶入有菌環境自然就涉及到一個慢慢適應的過程，其實就是一個引導適應性的階段。
5、管理
因為移栽後的苗比起自然生長的苗有一些不同的特點，因為自身出身「高貴」，所以就顯得「嬌氣」一些，對於施肥，用葯等各方面都需比普通苗注意很多，以保持移栽苗優良的品質。
希望對你有點幫助！

⑶ 簡述植物組織培養的步驟

植物組織培養方法
1
MS培養基的配製包括以下步驟。
培養基母液的配製和保存
MS培養基含有近30種營養成分，為了避免每次配製培養基都要對這幾十種成分進行稱量，可將培養基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養基母液。這樣每次使用時，取其總量的1/20(50
mL)或1/200(5
mL)，加水稀釋，製成培養液。現將制備培養基母液所需的各類物質的量列出，供配製時使用。
大量元素(母液Ⅰ)
mg/L
NH4NO3
33
000
KNO3
38
000
CaCl2·2H2O
8
800
MgSO4·7H2O
7
400
KH2PO4
3
400
微量元素(母液Ⅱ)
KI
166
H3BO3
1
240
MnSO4·4H2O
4
460
ZnSO4·7H2O
1
720
Na2MoO4·2H2O
50
CuSO4·5H2O
5
CoCl2·6H2O
5
鐵鹽(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O
5
560
Na2-EDTA·2H2O
7
460
有機成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇
20
000
ⅣB
煙酸
100
鹽酸吡哆醇(維生素B6)
100
鹽酸硫胺素(維生素B1)
100
甘氨酸
400
以上各種營養成分的用量，除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外，其餘的均為200倍濃縮液。
上述幾種母液都要單獨配成1
L的貯備液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配製方法是:每種母液中的幾種成分稱量完畢後，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然後再將它們混溶，最後定容到1
L。
母液Ⅲ的配製方法是:將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450
mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們溶解，然後將兩種溶液混合，並將pH調至5.5，最後定容到1
L，保存在棕色玻璃瓶中。
各種母液配完後，分別用玻璃瓶貯存，並且貼上標簽，註明母液號、配製倍數、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
MS培養基中還需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6BA)等植物生長調節物質，並且分別配成母液(0.1
mg/mL)。其配製方法是:分別稱取這3種物質各10
mg，將2，4-D和NAA用少量(1
mL)無水乙醇預溶，將6BA用少量(1
mL)的物質的量濃度為0.1
mol/L的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，最後分別定容至100
mL，即得質量濃度為0.1
mg/mL的母液。
配製培養液
用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量:母液Ⅰ為50
mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5
mL。再取2，4-D
5
mL、NAA
1
mL，與各種母液一起放入燒杯中。
配製培養液時應注意:①在使用提前配製的母液時，應在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發現瓶中有沉澱、懸浮物或被微生物污染，應立即淘汰這種母液，重新進行配製;②用量筒或移液管量取培養基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次;③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序寫在紙上，量取1種，劃掉1種，以免出錯。
溶化瓊脂
用粗天平分別稱取瓊脂9
g、蒸糖30
g，放入1
000
mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750
mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然後再將配好的混合培養液加入到煮沸的瓊脂中，最後加蒸餾水定容至1
000
mL，攪拌均勻。
調pH
用滴管吸取物質的量濃度為1
mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養基中，邊滴邊攪拌，並隨時用精密的pH試紙(5.4~7.0)測培養基的pH，一直到培養基的pH為5.8為止(培養基的pH必須嚴格控制在5.8)。
2
BA為細胞分裂素
NAA
是萘乙酸，為生長素的一種
3
適於百合根的激素暫時沒找到
以下是葉片和胚的激素:對麝香百合
(LiliumlongiflorumThunb)葉片進行離體培養
,可成功獲得無菌苗。試驗結果表明
:培養基MS
+BA
0
1mg/L
+NAA
1
0mg/L適於初代培養
,有助於根和芽的分化
;MS
+BA
0
5mg/L
+NAA1
5mg/L適於增殖培養
,利於愈傷組織的產生
,並促進芽的分化
;生根培養基為
1/
2MS
+NAA
1
0mg/L
+多效唑
10
0mg/L
;當試管苗根長
1cm時移栽易成活
在含有1
mg/
L
IAA,1
m
g/
L
GA3,6
0
0
m
g/
L
CH的
MS培養基上培養
,蔗糖含量為
6
%~
8%時
,百合幼胚胚性生長最好
,培養
30
d後可以得到正常胚
.在含有
0
.1
m
g/
L
NAA,1
m
g/
L
BA的
MS培養基上可以形成淡綠色的愈傷組織
,將這些愈傷組織轉移到
1
/
2
MS無激素的培養基上培養可以形成大量的不定芽
,不定芽生根移栽後
,其成活率可達90
%以上

⑷ 歧花鐵蘭莖段（側芽）的組織培養方法的步驟有哪些

①無菌材料獲得。取歧花鐵蘭花已凋謝的植株，切掉根部，逐層剝掉基部葉片，可看到葉腋間帶有淺棕色鞘葉的吸芽。小心的沿短縮莖向上剝掉所有葉片，最後切掉頂部的葉片，保留1～2mm的葉基或直接切掉莖尖。用0.1%HgCl2水溶液振盪消毒10min（加2滴吐溫），無菌水沖洗5～6次後，再用無菌紙吸干水分，在超凈台上吹乾。

取消毒好的外植體，用力切去被HgCl2水溶液接觸到的傷口部分，縱切2塊或不切，小切塊基部向下豎直接種到培養基。每塊莖外植體都有一個或部分側芽，主要誘導側芽萌發形成叢生芽。

②不定芽誘導。不定芽誘導培養基：MS＋6-BA2.0～4.0mg/L＋NAA0.1mg/L＋蔗糖30g/L＋卡拉膠5.8g/L，pH5.8～6.0。培養溫度25～29℃，光照時間10～12h/d，光照度20～30μmol/（m2穝）。

20d後，接種外植體變綠，短縮莖上的側芽逐漸萌發。將萌發的側芽分離，在相同的培養基中培養40d左右，可形成叢生芽。

③不定芽增殖。不定芽增殖培養基：MS＋6-BA2.0～3.0mg/L＋NAA0.1mg/L＋蔗糖30g/L＋卡拉膠5.8g/L，pH5.8～6.0。培養溫度25～29℃，光照時間10～12h/d，光照度30～40μmol/（m2穝）。

將叢生芽切分成小塊，接種到繼代培養基上，光照培養，每隔30～40d繼代1次，增殖系數在5.0以上。

④壯苗培養。壯苗培養基：MS＋蔗糖30g/L＋卡拉膠5.8g/L，pH5.8～6.0。培養溫度25～29℃，光照時間12～15h/d，光照度30～40μmol/（m2穝）。

把產生的叢生不定芽分成單株或切割成小塊後接種於培養基中。每瓶接種10株或叢生芽4塊。

⑤生根培養。生根培養基：MS＋NAA0.2mg/L＋蔗糖30g/L＋卡拉膠5.8g/L，pH5.8～6.0。培養溫度25～29℃，光照時間15～20h/d，光照度40μmol/（m2穝）。

當繼代增殖的叢生芽長高到3～4cm時，將叢生芽分成單株，接種到生根培養基上，每瓶10株。光照培養25d後，生根率達100%。生根苗葉片濃綠，植株粗壯。可置於蔭棚（70%～80%遮陰度）內煉苗，5～7d後可進行移栽。

⑥移栽。移栽時，用清水將黏附在根上的培養基洗凈，用0.2%～0.3%多菌靈水溶液浸泡10～15min，移栽到基質中，淋水定根。基質宜選疏鬆肥沃的表土並配以過篩的河沙及椰糠、泥炭為宜，並用土壤消毒劑消毒。移栽密度為每平方米100～120株。移栽後遮陰保濕10～15d，然後逐漸去掉保濕遮陰物。移栽成活率99%以上。

百劍鳳梨不定芽增殖及移栽

A.不定芽增殖B.移栽苗。

⑸ 離體細胞進行組織培養獲得胚狀體需要通過什麼過程

（1）胚狀體的培育需採用植物組織培養技術，該技術的原理是細胞的全能性．植物組織培養包括脫分化和再分化兩個步驟，決定植物脫分化和再分化的關鍵因素是植物激素的種類和比例，尤其是生長素和細胞分裂素的協同作用在組織培養過程中非常重要；植物組織培養需要無菌條件，因此還需要對培養基進行嚴格的消毒（或滅菌）．
（2）「離體的細胞」進行植物組織培養獲得胚狀體的過程：

⑹ 簡述植物組織培養的步驟

植物組織培養方法 1 MS培養基的配製包括以下步驟。
培養基母液的配製和保存 MS培養基含有近30種營養成分，為了避免每次配製培養基都要對這幾十種成分進行稱量，可將培養基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養基母液。這樣每次使用時，取其總量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL），加水稀釋，製成培養液。現將制備培養基母液所需的各類物質的量列出，供配製時使用。
大量元素(母液Ⅰ) mg／L
NH4NO3 33 000
KNO3 38 000
CaCl2·2H2O 8 800
MgSO4·7H2O 7 400
KH2PO4 3 400
微量元素(母液Ⅱ)
KI 166
H3BO3 1 240
MnSO4·4H2O 4 460
ZnSO4·7H2O 1 720
Na2MoO4·2H2O 50
CuSO4·5H2O 5
CoCl2·6H2O 5
鐵鹽(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O 5 560
Na2-EDTA·2H2O 7 460
有機成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇 20 000
ⅣB
煙酸 100
鹽酸吡哆醇(維生素B6) 100
鹽酸硫胺素(維生素B1) 100
甘氨酸 400
以上各種營養成分的用量，除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外，其餘的均為200倍濃縮液。
上述幾種母液都要單獨配成1 L的貯備液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配製方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢後，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然後再將它們混溶，最後定容到1 L。
母液Ⅲ的配製方法是：將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們溶解，然後將兩種溶液混合，並將pH調至5.5，最後定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。
各種母液配完後，分別用玻璃瓶貯存，並且貼上標簽，註明母液號、配製倍數、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
MS培養基中還需要加入2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、6-苄基嘌呤（6BA）等植物生長調節物質，並且分別配成母液（0.1 mg/mL）。其配製方法是：分別稱取這3種物質各10 mg，將2，4-D和NAA用少量（1 mL）無水乙醇預溶，將6BA用少量（1 mL）的物質的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，最後分別定容至100 mL，即得質量濃度為0.1 mg/mL的母液。
配製培養液 用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，與各種母液一起放入燒杯中。
配製培養液時應注意：①在使用提前配製的母液時，應在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發現瓶中有沉澱、懸浮物或被微生物污染，應立即淘汰這種母液，重新進行配製；②用量筒或移液管量取培養基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序寫在紙上，量取1種，劃掉1種，以免出錯。
溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然後再將配好的混合培養液加入到煮沸的瓊脂中，最後加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。
調pH 用滴管吸取物質的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養基中，邊滴邊攪拌，並隨時用精密的pH試紙（5.4～7.0）測培養基的pH，一直到培養基的pH為5.8為止（培養基的pH必須嚴格控制在5.8）。
2 BA為細胞分裂素 NAA 是萘乙酸，為生長素的一種
3 適於百合根的激素暫時沒找到
以下是葉片和胚的激素：對麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)葉片進行離體培養 ,可成功獲得無菌苗。試驗結果表明 :培養基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L適於初代培養 ,有助於根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L適於增殖培養 ,利於愈傷組織的產生 ,並促進芽的分化 ;生根培養基為 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;當試管苗根長 1cm時移栽易成活
在含有1 mg/ L IAA,1 m g/ L GA3,6 0 0 m g/ L CH的 MS培養基上培養 ,蔗糖含量為 6 %～ 8%時 ,百合幼胚胚性生長最好 ,培養 30 d後可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA,1 m g/ L BA的 MS培養基上可以形成淡綠色的愈傷組織 ,將這些愈傷組織轉移到 1 / 2 MS無激素的培養基上培養可以形成大量的不定芽 ,不定芽生根移栽後 ,其成活率可達90 %以上

⑺ 植物組織培養的流程

植物組織培養的流程：

第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鍾至數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。

第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈台或接種箱內完成，准備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手錶等。用70%酒精浸10～30秒。由於酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。

第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1～2種使用見表。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視採用的消毒液種類，涮洗3～10次左右。

(7)密花石斛離體組織培養的步驟擴展閱讀

組織培養技術是在人為創造的無菌條件下將生活的離體器官（如根、莖、葉、莖段、原生質體）、組織或細胞置於培養基內，並放在適宜的環境中，進行連續培養以獲得細胞、組織或個體的技術。

組織培養技術原理

植物組織培養的原理是細胞全能性。也就是說每個植物細胞里都含有一整套遺傳物質，只不過在特定條件下才會表達。

組織培養基於此原理就可以將已處於分化終端或正在分化的植物組織脫分化，誘導形成愈傷組織，再在愈傷組織上形成新的叢生芽。

組織培養技術的應用

（1）改良作物：增加遺傳變異性。

（2）繁殖植物：組織培養中從一個單細胞，一塊愈傷組織，一個芽（或其它器官）都可以獲得無性系。無性系就是用植物體細胞繁殖所獲得的後代。

（3）有用化合物：有用化合物包括葯物、橡膠、香精油、色素等。這些化合物許多都是高等植物的次生代謝物，有些化合物還不能大規模地人工合成，而靠植物產生這些化合物來源有限。因此，利用組織培養方法，培養植物的某些器官或愈傷組織，並篩選出高產、高合成能力、生長快的細胞株系，以進行工業化生產，是一條行之有效的途徑。

⑻ 葯用植物離體培養再生植株是什麼

（孫國棟）

一、培養再生植株的意義以植物組織培養為主要手段的植物生物技術，包括五個分支領域，即用離體技術改良植物品種，經濟植物的快速繁殖，超低溫種質保存，植物細胞的大量培養和植物遺傳工程。在葯用植物離體培養中，除了植物細胞的大量培養外，其餘都涉及到再生植株的培養。和一般的植物不同，培養葯用植物再生植株需要注意葯用成分的變化。

（一）快速繁殖

通過離體技術大量培養再生植株可以達到快速繁殖的目的，主要用於：（1）自然繁殖率低的植物；（2）性狀不一致的雜合植物，（3）資源稀少的瀕危植物；（4）新培育的優良品種；（5）優良芽變品種和性狀好的優選單株；（6）國外引入的少量植物材料；（7）育種過程中需要迅速擴大的某些自交系、原始材料、雜種子代；（8）組織培養或自然條件下獲得的三倍體與多倍體植物；（9）除去病原菌（真菌、細菌、病毒）的植物。快速繁殖技術能否應用取決於：（1）培養技術簡易、穩定、完善；（2）成本低於常規方法；（3）具有一定的設備條件和技術力量；（4）市場需要，價格適宜。如羅漢果、石斛。

（二）脫毒植株

通過莖尖培養，或者通過花瓣培養和愈傷組織長期培養，獲得除去主要病毒的脫毒植株，用它作為母株繼續繁殖，可以得到大量無病毒種苗，用於大田生產，可以提高產量和質量，防止品種退化。如地黃、菊花。

（三）種質保存

在4℃低溫或在液氮的低溫中，植物組織和細胞的生活力可以長期保持。可用於冷凍保存的植物材料有：（1）莖尖和側生分生組織；（2）培養的植物細胞和胚狀體；（3）原生質體；（4）植物器官，如胚、胚乳、子房、花葯、花粉和種子等。冷凍保存植物材料，可以節省人力、地力和物力。便於地區間和國際間種質交流，通過試管繁殖提供育種的原始材料和無病毒種苗。

（四）品種改良

用離體技術改良植物品種的方法主要有：（1）通過花葯、花粉、未受精子房、胚珠等培養獲得單倍體植株，進行單倍體育種；（2）通過胚乳培養獲得三倍體植株，或在植物組織培養中，通過秋水仙或其它因素處理獲得多倍體植株；（3）通過體細胞無性系變異和細胞突變體篩選，以獲得具有優良性狀的變異體和突變體；（4）原生質體培養和細胞雜交。不論採用何種育種技術，都必須誘導再生植株，並對後代進行鑒定。如人參、枸杞。

（五）植物基因工程

植物基因工程包括基因分離、載體系統和受體系統三個組成部分。它直接用控制性狀遺傳的基因作為操作對象，可以更精確地定向改良品種，目前分離和克隆的基因有20餘種。載體系統主要在研究膿桿菌的Ti質粒系統（agrobacterium tumerfaciens T-DNA）。作為受體系統，可以採用原生質體，懸浮培養的細胞，愈傷組織離體的植物器官或整體植株。無論採用何種受體系統，都必須使轉化的細胞再生為完整植物，植株再生是植物基因工程的一個主要環節。如龍葵、菘藍。

二、植株再生的基本原理

生物界普遍存在再生現象，生物再生是自然選擇和人工選擇的結果。通常低等生物具有較強的再生能力，神經系統愈發達的高等動物，再生能力愈弱。在植物中，細胞、組織和器官，在離體培養條件下，可以生長和發育，形成完整植株。但是，不同種植物，或者同種植物不同品種，甚至同一植物不同組織和器官的細胞，再生能力也有差別。通常野生植物比栽培植物再生能力強，無性繁殖的植物強於種子繁殖的植物。

植株再生的基礎在於細胞具有遺傳全能性，即每一個細胞含有產生一個完整有機體的全部遺傳信息，在適當的條件下，一個具有全能性的活細胞，其發育和分化，受其DNA上面的部分基因的被活化或阻抑所控制，一個細胞可以形成一個完全新的有機體。在離體培養物上再生植株，是離體培養物的細胞在各種環境因子的刺激和作用下，經過脫分化和再分化的結果。可能由於植物細胞分化狀況僅有相對的穩定性，在離體培養中，特異化的細胞比較容易經脫分化恢復全能性，全能性的脫分化細胞經過再分化，產生完整的小植株。其中分化是植株再生的中心問題，和許多因素有關。植物激素是化學信使，作為基因表達的「效應子」，對RNA和蛋白質的合成起直接影響，在細胞脫分化和再分化的過程中起著重要的、有時是決定性的作用。

雖然許多問題還非常不清楚，但是，植株再生的基本原理，目前認為是：（1）植物細胞全能性；（2）植物細胞的脫分化和再分化；（3）植物激素的平衡作用。這些基本原理，既是組織培養的一般指導原則，也是一些有待於深入研究的基本理論課題。

三、植株再生的基本途徑

從離體培養物上再生植株，存在兩條形態發生的基本途徑，即器官發生和胚胎發生。

這兩種形態發生，有的經過愈傷組織階段，有的則直接產生於離體的母體組織。

（一）器官發生

器官發生途徑是通過器官分化形成完整植株，如貝母、藏紅花、紫背天葵、蘆薈。離體培養物的器官分化，包括不定芽、不定根、鱗莖、球莖、塊莖、原球莖以及花的形成。通過不定芽和不定根形成再生植株，有三種方式：（1）先形成芽，而後在芽上產生根；（2）先形成根，而後在根上產生芽；（3）在愈傷組織上同時產生芽和根，以後芽和根之間形成維管系統，連結成統一的軸狀結構。大多數情況為第一種方式。通過鱗莖、球莖、塊莖、原球莖等器官分化，也有不同情形。

在植物組織培養中，雖然通過器官發生途徑再生植株的研究報道很多，但是有關基礎研究的資料仍很貧乏。大多數的研究繼續集中在外植體、培養基和環境條件這三類因子調控作用的經驗性操作。在大多數情況下，人們僅能觀察已經表現出來的分化狀態，而很難跟蹤分化的過程。與形態發生的起源和方向有關的因素，目前的認識還很模糊，在這些因素中，包括有離體培養體系中各類物質的變化和相互作用，這些物質來自培養基、外植體及其培養過程中的代謝產物。

在離體培養中，只有少量的細胞被啟動，而且起始是不同步的。Torrey（1966）提出擬分生組織假說，形態發生起始於愈傷組織中形成的分生細胞團，即擬分生組織。在培養體系內各種因子的作用下，由擬分生組織產生不同的原基，由於作用因子的性質不同，或者形成根，或者形成芽，或者發育為胚狀體。擬分生組織可能發生於組織與培養基的界面，其形成部位可能決定於從培養基向組織擴散的物質造成的生理梯度。

Skoog和Miller等提出激素平衡假說，認為器官分化和細胞分裂素與生長素的比例有關。在大多數情況下，生長素與細胞分裂素的高比值，利於根形成，而相反的比值利於芽的發生。由於外植體內源激素的存在和抑制物質的累積，也有不少相反的情況。在實際應用這一原則時，有時需要增加或省略某一類植物激素，對下述因素作出必要的考慮：（1）植物激素的種類和組合；（2）植物激素的絕對濃度；（3）植物激素，主要是細胞分裂素和生長素的比例；（4）植物激素的順序效應；（5）其它因素的影響，如外植體、營養條件、碳源種類和濃度以及其它理化因素。

（二）胚胎發生

從胚胎發生途徑再生植株是先形成胚狀體，通過胚狀體萌發而形成完整的小植株。在高等植物中胚狀體的發生是一個普遍現象，現在已觀察到40多科150多種植物具有胚胎發生能力。關於胚狀體的概念，朱澂提出（1978），胚狀體是植物組織培養中起源於非合子細胞，經過胚胎發生和胚胎發育過程形成的胚狀結構。這個定義包括下列幾點含義：（1）胚狀體是組織培養的產物，只限於在組織培養范圍內使用，區別於無融合生殖的胚；（2）胚狀體起源於非合子細胞，區別於合子胚；（3）胚狀體的形成經歷胚胎發育的過程，區別於組織培養中分化的芽體。

胚狀體的來源可以分為五類：（1）組織器官；（2）愈傷組織；（3）游離單細胞；（4）小孢子；（5）原生質體。其中有的起源於單細胞，有的起源於多細胞。胚狀體發生方式有兩種（Sharp et al，1980）：（1）直接發生：胚狀體形成不經過愈傷組織，直接來自離體培養組織中預決定胚性細胞（Preembryogenic determined cell）；（2）間接發生：胚狀體發生經過愈傷組織，從愈傷組織的誘導決定胚性細胞（Inced-embryogenic determined cell）發育而成。在培養體系有關因子的作用下，胚性細胞不斷分裂和增殖，形成胚性細胞團，進而發育成球形胚。通常胚性細胞較小，核大，細胞質濃厚，富有大的澱粉粒。球形胚組織可以與周圍組織分離，和合子胚發育過程相似，由球形胚發育分化為心形胚、魚雷形胚和具有子葉的成熟胚狀體。成熟的胚狀體形態和合子胚相似，具有胚根、胚芽和子葉。在分化培養基上，胚狀體像種子一樣萌發，胚軸伸長，葉片展開，發育根和形成葉綠素，多種器官再進一步生長形成小植株。由於胚狀體的形成，導致了人工種子的研製。

從胚狀體發生到植株形成是一個連續過程，可以分為三個連續階段：（1）胚狀體的起源；（2）胚狀體的分化；（3）胚狀體萌發生長，形成小植株。在實際操作中，胚性細胞的誘導及其形成胚狀體的發育過程，可能在同一個培養基上形成，或者分別需要經過兩次培養。胚狀體形成綠色植株，則需要轉至分化培養基。如果培養基中的化學物質，主要是植物激素的不平衡。胚性細胞的分化和胚狀體的發育會受到抑制，而發生畸形胚性組織塊。這些畸形結構也可能具有胚胎發生潛力。

胚胎發生與植物激素的關系因植物而異，可有幾種類型：

1.專一性生長素型

胚胎發生必須有生長素存在，其它植物激素的存在起抑製作用。這種類型又有兩種情況：（1）誘導胚性細胞必須有生長素，胚狀體形成和發育，則需要降低或者去除生長素，如胡蘿卜；（2）胚狀體誘導和發育可在同一生長素培養基上進行。如人參。

2.非專一性生長素型

胚胎發生需要生長素，其它植物激素，如細胞分裂素、赤黴素或脫落酸，在一定配比下有協同作用，如酸棗。

3.非生長素型

胚胎發生不需要生長素，可在細胞分裂素培養基上形成，如檀香。

4.非激素型

胚胎發生不需要植物激素，如曼陀羅花葯培養。

胚狀體分化綠苗，通常需要降低或去除生長素，而細胞分裂素、赤黴素具有主要作用，如人參、西洋參。

在體細胞胚胎發生中，還原態氮化物具有重要作用。還原態氮化物包括無機氮，如NH+4；有機氮化物，如氨基酸、醯胺、水解酪蛋白等。在通常情況下，還原態氮化物有利於胚狀體的發生，但是作用機理並不清楚，不同植物反應也不相同。許多研究表明，生長素和還原態氮化物的濃度比例可能起著重要作用。

不同植物不同離體培養物再生植株的途徑可能不同，有的主要通過器官發生途徑，如煙草，有的很容易發生胚狀體，如胡蘿卜。但是許多植物再生植株，既可以通過器官發生途徑，也可以通過胚胎發生途徑，植物激素可以進行調控，如人參、西洋參等。通常誘導芽體分化需要細胞分裂素，誘導胚狀體發生則生長素起重要作用。

在離體培養物上分化芽體和胚狀體，它們的主要區別在於：芽體具有單極性，與離體培養物有維管組織聯系，根和芽不同時產生；胚狀體具兩極性，即有根端（胚根）和莖端（胚芽），與離體培養物無直接聯系，是一個完整的植物體雛形。由於體細胞胚胎發生研究的進展，導致了人工種子的研製。

四、植株再生的限制因素

（一）植株再生的限制因素

在離體培養物上再生植株，可以分為外植體、培養基和環境條件三類調控因子。在這三類因子中，雖然它們的作用都很重要，但是比較起來，植株再生能否成功，限制因素主要不在於培養基，而在於培養材料本身，即培養材料細胞全能性的表達程度。

1.遺傳型（基因型）的影響

不同植物種之間再生能力有很大差別，有的再生能力很強，如茄科、傘形科、十字花科等；有的再生比較困難，如豆科植物。同一種植物不同品種再生能力也有不同。由於遺傳型的影響，決定了植株再生的難易程度和應用前景。我們在研究五加科葯用植物人參、西洋參、三七和刺五加種胚培養再生植株時，得到下述結果：（1）在附加BA2mg/l+NAA0.5mg/l的培養基上，人參和西洋參種胚培養物可以直接啟動芽分化，轉入含有赤黴素的培養基上則形成不定芽，而三七和刺五加則無芽體分化。（2）在有生長素的培養基上，這四種葯用植物種胚培養物上均有胚狀體發生，但是對生長素的種類和濃度反應不同。在附加2，4-D0.5—1.0mg/l時，胚胎發生能力依次為：西洋參＞人參＞刺五加，而三七未觀察到胚胎發生。在含有IAA的培養基上，高濃度的IAA促進人參種胚體細胞胚胎發生，而三七和刺五加則以低濃度IAA為宜。（3）在上述的生長素條件下，人參和西洋參為間接胚胎發生，而三七和刺五加為直接胚胎發生。

2.外植體的來源

在離體培養中，可用作培養的材料很多，包括器官、組織，甚至單細胞。雖然植物細胞具有全能性，但它的表達可能僅限於某些特殊的細胞，這些細胞可能預先存在於外植體中，或者產生於培養過程之中。許多實驗表明，培養材料的特性，不僅影響再生的可能性，而且影響植株增長速率和植株的品質。在選用培養材料時可以觀察到，分生組織易於分化，子葉基部再生較強，成年樹木的葉片，可能逆轉性較差，細胞全能性難以表達。我們在研究西洋參離體培養再生植株時，不同外植體來源的愈傷組織，細胞全能性的表現程度不同（表13—10）。

表13—10 西洋參不同外植體愈傷組織細胞全能性的表現程度

3.外植體的狀況

外植體的發育階段和年齡，外植體內源激素和生理狀態（取材季節），外植體大小，外植體的預處理，以及母體植株的質量等均影響植株再生的能否成功。在選擇外植體時，需要了解植物的生物學特性。

（二）外植體的種類和選用

在離體培養中，可供外植體的材料多種多樣，可以根據研究目的、再生途徑和實驗經驗進行選用。

1.帶芽的外植體

包括莖頭、側芽、原球莖、鱗莖等，這類外植體產生的植株成功率較高，變異性較小，容易保持材料的優良特性，通常用於快速繁殖和培養無病毒植株（莖尖培養）。在培養時，為了誘導莖軸伸長，在培養基中多附加有生長素和赤黴素；如果誘導腋芽生長以產生叢生芽，在培養基中常含有大量的細胞分裂素。

2.由分化的組織構成的外植體

包括莖段、葉片、根等營養器官；花莖、花瓣、花萼、花葯、子房，胚珠、果實等生殖器官。這類外植體在培養過程中通常形成愈傷組織，通過器官發生和胚胎發生途徑再生植株。通過器官發生途徑再生植株，通常選用在自然條件下能產生不定芽的器官組織，這要根據不同植物的特性加以選擇，例如蘆薈選用莖段，菊花選用花瓣，百合選用鱗片等。通過胚胎發生途徑，常選用胚、幼嫩花序、分生組織等作外植體。這類外植體再生植株變異性較大，可用於無性系變異和突變體篩選，或者用於單倍體育種，如花粉植株。

3.由遺傳轉化的細胞構成的外植體

主要是指冠癭瘤轉化系統和直接DNA轉化系統，用於植物遺傳工程。

五、再生植株的培養方法

（一）再生植株的培養步驟

1.建立無菌培養物

這一步驟包括選取外植體，材料表面滅菌和在培養基上接種培養。能否得到無菌培養物，首先決定於植物材料的狀況，應盡可能使用在培養室或溫室栽種的生長健康旺盛的材料。田間材料滅菌比較困難，常採用下述方法：（1）用抗菌素溶液和殺菌劑預處理植株；（2）用塑料袋包裹枝條；（3）採回枝條扦插，利用新生的芽；（4）對培養材料進行多次滅菌。有一些植物的外植體在接種後和培養過程中發生褐變，可以選用一些抗氧化劑、解毒劑或吸附劑加入到培養基中，如檸檬酸、抗壞血酸，及半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、二硫蘇糖醇、促長啉、氯胺丁、二乙基二硫代氨基甲酸酯、活性炭等，以改善褐變情況。

2.愈傷組織的培養

愈傷組織是植物組織培養中最常遇到的一個階段，為了快速繁殖遺傳性一致的優良株系，使變異小於3%，需要盡量避免愈傷組織，然而在品種改良方面，誘導愈傷組織是有益的。

愈傷組織通常產生於外植體傷口的表層細胞。愈傷組織的生長特性取決於植物材料、培養基和環境條件，從外植體到愈傷組織建立，大體上經歷誘導、細胞分裂和分化階段。在外界條件尤其是植物激素的作用下，少數細胞被啟動，新陳代謝加強，而進入活躍的細胞分裂，外植體細胞逆轉為分生組織，或脫分化為愈傷組織。愈傷組織的生長沒有明顯的極性，只有內外的生長陡度，外圍的細胞分裂和生長快於內部細胞。第三個時期，愈傷組織出現細胞分化和產生某些次生代謝產物。愈傷組織最重要的特徵是可以通過器官發生或胚胎發生形成根、芽和胚狀體，進而形成小植株。

愈傷組織通常表現為淡黃色、白色、綠色，有的含有花色素苷形成的顏色。愈傷組織有鬆散型和緊密型。同一來源的愈傷組織，在繼代培養中經過人工篩選，可以得到不同的細胞系，它們在細胞分化程度、顏色、生長速度、對營養條件和激素條件的要求、合成特殊物質的能力等方面有很大的差異。變異是愈傷組織另一個重要特徵。這些變異有表現型變異和基因型變異。基因型變異可能有倍性變化，染色體畸變、基因序列變化。通過對有益變異的選擇可以用於品種改良。

從外植體形成愈傷組織，與植物激素的關系大致有下述情況：（1）僅需要生長素；（2）僅需要細胞分裂素；（3）需要生長素和細胞分裂素；（4）不需要植物激素。在大多數情況下，生長素是誘導愈傷組織的主要因子。

在培養過程中，由於營養逐漸耗盡，瓊脂失水逐漸變干，代謝產物累積而使毒性提高，愈傷組織培養一段時間需要轉移至新鮮培養基上進行繼代培養，在固體培養基上，一般4—6周繼代培養一次。轉移的培養體，大約5—10mm，重20—100mg左右（Street，1969）。體積太小可能生長很慢，或者不生長，但是在進行抗性篩選時，培養體體積要小些。愈傷組織繼代培養基和脫分化培養基的成分和激素條件，可能相同，也可能不同，因植物而異。由於長期繼代培養使內源激素含量增加，繼代培養基的激素種類和含量需要作適當的調整。

3.無性系的建立

從離體培養物上建立無性系，經常遇到變異、細胞分化能力喪失和出現玻璃苗等問題。對每一種植物的離體培養，需要通過大量的試驗，確定最佳培養條件，使之程序化，以便達到應用目的。建立無性系的途徑大致可用圖13—2表示。

圖13—2 無性系建立示意圖4.生根

從芽和嫩枝誘導生根的難易程度首先取決於植物的遺傳型。草本植物一般比木本植物容易。成年樹產生的芽和嫩枝，比幼態樹的生根困難。誘導生根通常在生根培養基上加入適量的生長素，如萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚乙酸。有些植物可以在無激素培養基上生根。生根培養基可以和前培養基相同，也經常使用1/2、1/3或1/4濃度的高鹽培養基，或者總鹽濃度較低的培養基。鐵鹽有益於根的形成，一般維持原濃度。蔗糖對於生根是必要的，不同的植物需要量可能不同。

一些難以生根的植物可以試用一些其它的方法：（1）用高濃度生長素溶液預處理若干小時，而後用無菌水洗凈接入無激素培養基；（2）使用濾紙橋或蛭石代替瓊脂作支持物誘導生根；（3）在生根培養基上添加一些附加物，如活性炭、B9、二甲亞碸、根皮苷、根皮酚等物質；（4）在試管中誘導休眠器官，如小塊莖、小球莖、地下莖等；（5）切割嫩枝直接進行扦插或水培等。

5.移栽

有的植物移栽比較容易，例如：蘆薈試管苗直接移入土中，成活率可達100%，而人參試管苗移栽目前尚未見有成功的報道。對於許多植物需要具體研究其特殊的移栽技術。

（1）培養壯苗，移栽前進行鍛煉。

（2）逐步過渡，先經過人工基質，如蛭石、砂粒、珍珠岩、焦渣、心土等，而後移入土壤。對於易感病的植物，人工基質可採用高溫滅菌、化學滅菌或葯劑滅菌。

（3）選擇合適的移栽時期。許多木本植物和一部分草本植物，當根原基突起或形成幾毫米短根時移栽成活率最高。有的草本植物可進行二次生根誘導，在第一次生根老化後再誘導新根進行移栽。

（4）控制移栽環境條件，保持高濕度和良好通風，避免陽光直射和溫度過大波動。有些植物需要模擬其生態環境。

（5）病害及時防治。常見為立枯病，可用多菌靈等農葯對幼苗和基質進行定期噴灑。

（6）進行試管苗嫁接。

（二）培養基和環境條件

1.培養基

根據培養材料和培養目的，植物組織培養可以分為許多種類，如器官培養，莖尖培養，花葯和花粉培養，子房和胚珠培養，胚胎培養，胚乳培養，果實培養，細胞懸浮培養，分生組織培養，愈傷組織培養，原生質體培養和細胞融合等。不同植物不同種類的組織培養需要選用不同的培養基。目前可供植物組織培養的培養基約有250餘種。對於一般的試管繁殖，為了降低生產成本，有的採用簡化培養基，用食用糖代替試劑用蔗糖，用普通水代替蒸餾水配製培養基。靜置淺層液體培養比瓊脂固體培養可降低成本70—80%，目前已用於一些植物的快速繁殖。

2.環境條件

包括培養基酸鹼度，培養溫度、光照條件和通氣條件等。

一般植物組織生長的最適pH在5—6.5之間，固體培養基常用pH5.8，液體培養基常用pH5.0。

培養溫度一般為20—28℃左右。高溫（大約為27℃）適合於熱帶品種，低溫（20℃左右）有利於高山植物的離體培養。在試管內形成鱗莖球莖、塊莖等休眠器官時，其萌發常需要低溫處理。

愈傷組織培養一般可在暗中進行。對於光自養離體培養物培養、器官發育和植株形成需要光照。光照強度范圍300—10000lx，一般1000—3000lx。一般培養室可設計用自然光代替日光燈。一些研究表明，不同波長的彩色光對愈傷組織的建成和器官的分化表現一定的影響，而且隨植物種類和器官不同而異。光照時間因植物特性和實驗目的而定，可連續光照，或周期性光照10—16小時。塊莖和其它貯藏器官的形成可能需要較長的黑暗時期。研究花器官發生時需要根據植物特性控制光照時間。

在固體培養基上通常可以不考慮空氣成分，雖然在培養過程中有乙烯產生。液體培養需要注意通氣。細胞懸浮培養一般採用振盪法通氣。在器官分化時，可用轉床，使組織能間隔在液體培養基中生長。小體積的靜置淺層液體培養，培養時間需要縮短，大約四周繼代培養一次。為了保存繁殖材料，仍應採用固體培養。

六、我國葯用植物離體培養再生植株研究概況

在葯用植物栽培生產中，不少名貴葯用植物生長周期長，用常規育種需要很長時間，如人參、黃連等。有的葯用植物繁殖系數小，耗種量大，如貝母、番紅花等。有的因病毒為害而退化，影響產量和質量，如地黃、太子參等。一些價格昂貴的野生葯用植物資源極少，生長緩慢，如黑節草、霍山石斛等。一些進口南葯因種苗奇缺而影響擴大生產，如乳香、血竭等。為了應用植物生物技術對葯用植物進行品種改良、快速繁殖、種質保存和開展遺傳工程研究，葯用植物離體培養再生植株的研究和應用日益引起人們的興趣和重視。

目前，離體培養的試管葯用植物已達百種以上，如：爵床科九頭獅子草（Peristrophe japonica），獼猴桃科中華獼猴桃（Actinidia chinensis）、中華獼猴變種（A.chinensis var.sp.）、硬毛獼猴桃（A.chinensis var.hispide）夾竹桃科長春花（Catharanthus roseus）、夾竹桃（Nerium indicum）、蛇根木（Rauwolfia serpertina），五加科刺五加（Acanthopanax senticosus）、人參（Panax ginseng）、竹節參（P.japonicus）、西洋參（P.quinquefolium）、三七（P.notoginseng），蘿摩科馬利筋（Asclepias curassavica）、印度娃兒藤（